Protocolo da estimulação da pilha

A estimulação da pilha estuda o protocolo

Inicialmente gire abaixo das pilhas, lyse para a extração do RNA, RT-PCR para 20, 25, 30 ciclos e faça a diluição de série do RNA para evitar a saturação (dilue: 50x, 100x, 25x, 500x).

1. Para uma garrafa 90-100% T-75 confluente

2. Lavagem com 10 mL PBS

3. Trypsinize com 1.5 mL de trypsin

4. Incube por 15 minutos em 37 graus

trypsinization 5.Stop adicionando media de 20 mL à garrafa

6. Transfira tudo a um tubo de 50 mL

7. Lave a garrafa com media de 10 mL

8. Adicione isto 10 mL ao mesmo tubo de 50 mL

9. Gire 10 minutos na meia velocidade

10. Aspire media

11. Adicione media frescos de 3 mL

12. Introduza com pipeta acima e para baixo com uma seringa de 3 mL e uma agulha de 19.5 calibres para quebrar acima grupos da pilha

13. Dilua a 50 mL de volume total

14. Chapeie 2 mL por bem em 6 placas boas. Tão um T-75 pode chapear em 4 x 6 placas boas.

15. Permita o crescimento na placa por 24 horas

16. Mude media aos media descascados chracoal

17. Permita o crescimento na placa por 24 horas

18. Se após 24 horas, as pilhas são 80% confluentes, media da mudança outra vez aos media descascados carvão vegetal 3 mL/well e estimulam com 30 microlitres do esteróide e ' - do aza-deoxycytidine 5.

19. Incube por 24 horas, colha 4 e 5 jogos para a análise do RNA

media aspirados A.

pilhas da lavagem do B. duas vezes com cuidado com PBS frio

o C. trypsinize ou raspa

o D. adiciona 1 mL de Trizol a cada um bem

agitação ou lugar do E. no rotor por 15 minutos

transferência do F. de cada um bem em um tubo de centrifugador de 1.5 mL

o G. prosigue com extração do RNA

20. Incube por 7 dias, colha 1-3 para a análise da proteína

supernatant de transferência do A. aos tubos do falcão de 5 mL

do B. da rotação pilhas para baixo

supernatant e movimento da tomada do C. sobre aos ensaios e à análise da proteína

Refira por favor nossos outros muitos protocolos se isto é não faz encontra suas necessidades atuais.