Tratamento das pilhas com 5-Aza-2'- Deoxycytidine
5-Aza-2'- Deoxycytidine: Agentes de Demethylating e Reactivation de genes silenciados
Os genes silenciados impròpria pelas mudanças estruturais da cromatina que envolvem o methylation do ADN podem reactivated demethylating agentes, de que podem inverter estas mudanças e, conseqüentemente, para restaurar caminhos celulares principais. Isto conduz à re-expressão do gene e ao reversion de alguns aspectos do estado transformado. O azacytidine demethylating do agente 5 e seu derivado 5 aza-2'deoxycytidine do deoxy foram sintetizados primeiramente em Czechoslavakia como agentes quimioterapêuticos potenciais para o cancro (Cihak, 1974). Estes agentes são incorporados nos ácidos nucleicos de dividir as pilhas, onde actuam como inibidores mecanismo-baseados de methytransferases do ADN. Inactivate methyltransferases do cytosine C5- do ADN com a formação de complexos estáveis entre os 5 resíduos do deoxycytidine de aza-2'- no ADN e a enzima, imitando desse modo um intermediário estável do estado de transição quando encadernados à enzima do methyltransferase (Sheikhnejad e outros, 1999).
Estes inibidores poderosos do methylation do ADN, podem restaurar a função do gene às pilhas tratadas na cultura, que indicou que pode ter o potencial em tratar pacientes com a doença maligno (Lubbert, 2000; Jones e Baylin, 2002).
MÉTODOS e MATERIAIS: Um protocolo para o tratamento das pilhas com 5-Aza-2'- Deoxycytidine
As pilhas são semeadas em uma densidade de pratos de 5x10 5 /100-mm, cultivadas por 48 horas, e tratadas com os 0, 50, ou 100 aza-C.C. de m M 5 (produto químico Co., St Louis, DM) (Li e outros, 2001) do Sigma.
Quarenta e oito horas após o tratamento, as pilhas são lavadas com PBS e o media fresco foi adicionado. As pilhas são incubadas mais para uns outros 48 h antes do RNA celular total isolado.
Para estudos da proteína, as pilhas são semeadas em uma densidade de pratos de 5x10 5 /100-mm, cultivadas para 24 h, e tratadas com os 0, 1, 2, 3, 5, e 10 aza-C.C. de m M 5. Após 5 dias, os supernatants da pilha são colhidos e centrifugados em 1.800 RPM para granular e remover todos os restos de pilha. Supernatants subseqüentemente é transferido a um tubo novo e analisado para concentrações da proteína ou armazenado em -20 0 C.
